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Fibao Una perspectiva molecular en medicina
REVISIÓN
Terapia con ARN
Tratamiento
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Fecha de Publicación: 10-11-2007 Última actualización : 10-11-2007
Resumen
El uso de moléculas de ARN en la terapia de determinadas enfermedades surge como alternativa para solucionar algunos problemas de las estrategias propias de la terapia génica tradicional. Los recientes avances en el conocimiento de la biología del ARN, como ha sido el descubrimiento del proceso de interferencia por ARN (ARNi), han permitido la investigación de las posibilidades del ARN como molécula terapéutica de determinadas enfermedades genéticas.
Introducción
En esta animación se describen las causas a nivel genético de la beta talasemia y se explica la terapia con oligos antisentido de la beta talasemia.
La terapia basada en ARN tiene como finalidad modular la expresión de los genes causantes de la enfermedad empleando moléculas de ARN que reconocen a los ARNm producto de la transcripción de esos genes. Con el empleo de ARN como molécula terapéutica se solucionan algunos problemas de las estrategias basadas en la terapia génica convencional:

• Problemas de baja eficiencia de transferencia del transgen. El ARN se transfiere más fácilmente.
• Problemas del tamaño del transgen a tranferir. Las terapias con ARN usan construcciones de pequeño tamaño y no tienen el problema de la terapia génica convencional que en algunos casos necesita transgenes correspondientes a genes de gran tamaño para los que es difícil encontrar vectores adecuados.
• Problemas de inmunotoxicidad debida a los vectores.
• Problemas derivados de la inserción del transgen en el genoma de la célula diana. El ARN actúa sin insertarse en el genoma.

La molécula de ARN que va a actuar como molécula terapéutica podrá eliminar el ARNm diana o modificarlo añadiendo o eliminando fragmentos del ARNm correspondientes a exones alterados o a intrones que aparecen en el ARNm de forma anómala. En general las estrategias basadas en ARN van a actuar alterando el proceso de “splicing”, promoviendo un proceso conocido como “trans-splicing” o participando en fenómeno de interferencia por ARN (ARNi).

Estado actual
En esta animación se explican las causas a nivel genético de la distrofia muscular de Duchenne y la terapia con oligonucleótidos antisentido diseñada para tratar esta enfermedad.
Manipulación del “splicing” de pre-ARNm basada en oligonucleótidos antisentido

Recientemente se ha descubierto el potencial de los oligonucleótidos antisentido (AOs: Antisense Oligonucleotides) para alterar el procesamiento de los pre-ARNm a nivel del mecanismo de “splicing”. Su mecanismo de acción se basa en:

• El bloqueo de determinados “motifs” (motivos) en el ARN necesarios para que se produzca el “splicing”
• En la adición o la eliminación de fragmentos de ARN con el fin de retirar la zona de ARNm portadora de la mutación o de recuperar el marco de lectura perdido.

Aproximadamente el 10% de las mutaciones anotadas en la base de datos Human Gene Mutation Database afectan a sitios implicados en el procesamiento de ARNm, de ahí el gran campo de aplicación de las estrategias basadas en la modificación de los procesos de “splicing”.

Bloqueo de “motifs” ocultos para “splicing”

El primer caso en el que se emplearon oligonucleótidos antisentido para bloquear sitios de ARN necesarios para el “splicing” fue la beta-talasemia.La beta–talasemia está causada por una mutación en el gen de la cadena beta de la hemoglobina. Las mutaciones más frecuentes que provocan la enfermedad suponen la aparición de un sitio anómalo de “splicing” que hace que en el ARNm aparezca parte del intrón 2. La aparición de este sitio supone que los intrones 1 y 2 no se corten apropiadamente y que parte del intrón 2 quede incorporado al ARNm maduro. Este fragmento del intrón 2 contiene un codón stop que provoca la síntesis de cadenas beta de hemoglobina truncadas. Se ha comprobado que el bloqueo de este sitio anómalo de “splicing” del intrón 2 con oligonucleótidos antisentido en células precursoras de la serie eritroide restaura la síntesis correcta de la cadena beta de la hemoglobina.

Exclusión de exones

En algunos casos la eliminación de exones supone una buena vía para conseguir una forma de la proteína que sea funcional pero que no cause la enfermedad. Esta estrategia de exclusión de exones se está estudiando como tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne en la que la proteína distrofina (codificada por el gen Dmd) está alterada y se sintetiza una forma mutante de tamaño mucho menor que la normal. Esta alteración se debe a mutaciones que originan codones stop o a delecciones en el gen de la distrofina. En el modelo de ratón para esta enfermedad se consiguió sintetizar una forma funcional de la distrofina favoreciendo la exclusión de los exones que contenían las mutaciones que originaban codones stop empleando oligonucleótidos antisentido.

Estas aproximaciones basadas en oligonucleótidos antisentido también se han estudiado in vitro en modelos humanos de la enfermedad de Duchenne. El éxito de estas pruebas y la demostración de la corrección de los transcritos de la distrofina en muestras de músculo de pacientes afectados por la enfermedad han creado una gran esperanza en el uso de estas aproximaciones como terapia para la distrofia muscular de Duchenne con ensayos clínicos en Fase I (Phase I clinical trials)

Introducción de exones

Muchas enfermedades están causadas por la presencia de isoformas de la proteína que carecen de algún exón necesario para ejercer su función correctamente. En la mayoría de los casos estas enfermedades están producidas por mutaciones que suponen la activación de secuencias silenciadoras del “splicing” o la inactivación de sitios potenciadores del corte de exones (ESEs: Exon Splicing Enhancers). Los ESEs son secuencias que facilitan la inclusión del exón en el que se encuentran en el ARNm. Este es el caso de la enfermedad de la atrofia muscular espinal donde una mutación silenciosa en el exón 7 del gen SMN2 inactiva el sitio ESE de modo que no se produce la inclusión del exón 7 en el ARNm maduro. Esta isoforma es inestable y es la causante de la enfermedad. Se ha estudiado el uso de oligonucleótidos antisentido para bloquear el sitio de “splicing” de 5’ del exón 8 para que no compita con el del exón 7 y éste quede incluido en el ARNm maduro. También se ha estudiado el uso de oligonucleótidos antisentido específicos para la zona mutada que contengan una secuencia ESE intacta que pueda ser reconocida por el complejo molecular y se produzca el “splicing” correctamente.

La eficacia de estas estrategias en la producción de la isoforma de la proteína SMN funcional se ha comprobado en células obtenidas de pacientes con atrofia muscular espinal, donde se consiguió la introducción del exón 7 mediante el uso de oligonucleótidos antisentido específicos para secuencias silenciadoras del “splicing” localizadas en el exón 6. También en fibroblastos de pacientes afectados por esta enfermedad se llevó a cabo una transfección con un oligonucleótido que contenía secuencias potenciadoras del corte de exones. En este último caso se observaron unos niveles del 60% de la isoforma que contenía el exón 7 cercanos al 85% presente en individuos no afectados por la enfermedad.

A pesar de los buenos resultados que se están obteniendo in vitro con estas estrategias es conveniente señalar que aún existen algunas complicaciones. Por ejemplo, para llevar a cabo un tratamiento terapéutico basado en la eliminación de un exón es necesario que el exón a eliminar no tenga un papel crucial en la función de la proteína. Otro problema es la necesidad de readministrar los oligonucleótidos ya que tienen una vida media corta en el interior de la célula y actúan solamente a nivel del transcrito que se ha producido y no a nivel del gen que puede continuar transcribiéndose dando lugar a nuevos transcritos de forma indefinida. Además, los posibles efectos secundarios de un tratamiento in vivo con oligonucleótidos antisentido aún no están bien estudiados.

“Trans-splicing” del ARN

El proceso de “trans-splicing” es un proceso en el que se produce un “splicing” entre dos pre-ARNm transcritos por separado. Es un proceso natural aunque raro en mamíferos.

El descubrimiento de este mecanismo diferente de “splicing” ha permitido el desarrollo de métodos para reparar pre-ARNm causantes de enfermedades mediante el cambio de parte del transcrito. Estos métodos pueden estar basados en la maquinaria molecular “spliceosoma” llamados SMaRT (Spliceosome mediated RNA trans-splicing) o basados en ribozimas. En ambos casos se va a producir un reemplazamiento de parte del pre-ARNm por un fragmento libre de mutaciones.

Los métodos SMaRT se basan en la introducción de una molécula de pre-ARNm diseñada especialmente para que lleve a cabo el proceso de “trans-splicing” con la molécula de pre-ARNm diana que se encuentra en el núcleo de la célula. A esta molécula de pre-ARNm se le llama PTM ( pre-RNAm trans-splicing molecule). Se trata de un proceso específico ya que para que se produzca la reacción es necesario que la molécula PTM reconozca y se una al pre-ARNm. La reparación del transcrito empleando este método supone el reemplazamiento del fragmento del pre-ARNm que contenía las mutaciones causantes de enfermedad por un fragmento sin mutaciones. En ensayos con modelos preclínicos de fibrosis quística, hemofilia A e inmunodeficiencia asociada al cromosoma X se ha observado una buena corrección del transcrito portador de las mutaciones que provocaban la enfermedad.

Los métodos basados en ribozimas emplean estas moléculas para llevar a cabo el “trans-splicing”. Las ribozimas catalizan el “trans-splicing” entre la molécula de ARNm a la que reconocen específicamente y su región 3’. El empleo de estos métodos consiguió la reparación de la cadena beta de la hemoglobina en precursores de la serie eritroide de pacientes con anemia falciforme.

ARN de interferencia: Silenciamiento de isoformas de ARNm específicas y alelos mutantes

El proceso conocido como interferencia por ARN o ARNi (RNAi : RNA interference) es un proceso celular muy conservado en el que se produce el silenciamiento de determinados genes de un modo altamente específico. La molécula clave en este proceso es una molécula de ARN de doble cadena de unos 21 nucleótidos de longitud conocida como ARN interferente pequeño (siRNA : small interfering RNA). La molécula de siRNA será la responsable del silenciamiento génico actuando sobre los ARNm con los que se une específicamente. Las moléculas de siRNA pueden ser sintetizadas artificialmente e introducidas en las células diana o pueden proceder de la expresión de unos genes llamados miRNA (micro-RNA) muy importantes en procesos de diferenciación y desarrollo.

Dado que este proceso es altamente específico, ya que depende de la complementariedad de bases entre la molécula de siRNA y el ARNm diana, se podría emplear en situaciones en las que fuese necesario distinguir entre dos alelos o isoformas de la proteína.

Empleando moléculas de siRNA específicas para regiones de ARN presentes exclusivamente en una isoforma conseguiríamos reducir la expresión de la isoforma correspondiente. Por ejemplo, se ha conseguido la reducción de la expresión de la isoforma VEGF165 que es una isoforma de la proteína VEGF (vascular endotelial growth factor) fuertemente implicada en angiogénesis diseñando siRNA específicos para una región de ARN que no se encuentra en los ARNm correspondientes a las demás isoformas.

La inhibición de la expresión de un alelo mutante también es posible haciendo uso de siRNA específicos para la zona del ARNm donde se encuentra la mutación que los diferencia del alelo normal. De este modo la molécula de siRNA actuará solamente sobre el alelo mutante. El silenciamiento de alelos mutantes con ARNi se ha estudiado en patologías como osteogénesis imperfecta, anemia falciforme, degeneración primaria de la retina y ataxia espinocerebelosa.

El empleo de siRNA tiene algunas limitaciones como la activación del sistema inmunitario a través de la vía de los receptores TLR o el silenciamiento colateral de genes que no son el gen diana.

Conclusiones
En esta animación se explica el mecanismo del ARN de interferencia que es uno de los sistemas que se está aplicando en las terapias con ARN.
A pesar de los grandes resultados obtenidos in vitro en el uso de estos métodos en la corrección de determinadas enfermedades, la aplicación de estas estrategias como terapia in vivo en pacientes aún no está optimizada. Al igual que en estrategias propias de la terapia génica convencional el problema de hacer llegar la molécula terapéutica al tejido diana está aún por resolver.
Bibliografía