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Fibao Una perspectiva molecular en medicina
REVISIÓN
Aplicaciones de los transposones
Prevención
Tratamiento
Etiopatogenia
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Fecha de Publicación: 31-8-2009 Última actualización : 19-1-2010
Resumen
Los transposones son segmentos de ADN con la capacidad de moverse a lo largo del genoma. Esta característica de los transposones puede explotarse para utilizarlos como vectores de genes para la manipulación del genoma. Los transposones pueden usarse como vectores para realizar transgénesis de células somáticas y de línea germinal y en la generación de mutantes tanto con pérdida de función como con ganancia de función. Además los transposones pueden cobrar una gran importancia en las aplicaciones clínicas de terapia celular ya que permiten transferir genes a células madre.
Introducción
La aminación describe de forma esquemática el mecanismo de acción de las transposasas de tipo I

Los elementos transponibles son elementos genéticos móviles. Dependiendo de su mecanismo de transposición existen 2 tipos: de clase I y de clase II. Los de clase I o retrotransposones se mueven a través de un intermediario de ARN mediante un mecanismo de tipo copiar y pegar. Los de clase II usan un intermediario de ADN y un mecanismo de cortar y pegar. Los transposones más abundantes en mamíferos son los de tipo LINE (Long Interspersed Nuclear Elements). Los LINE-1 contienen 2 ORFs. Una ORF es una proteína de unión a ADN y la otra ORF codifica una proteína con actividad endonucleasa y retrotranscriptasa. La actividad endonucleasa permite cortar una de las cadenas de ADN y la retrotranscriptasa inicia la transcripción reversa en ese punto desde el extremo 3’ del ARN de la LINE-1.

Los transposones de clase II se mueven por un mecanismo de cortar y pegar. Estos transposones codifican una transposasa y están flanqueados por repeticiones terminales invertidas que incluyen los sitios de unión a la transposasa necesarios para que se lleve a cabo la transposición. La transposición resulta en la escisión del elemento del ADN en el que se encontraba y su integración en una nueva región del ADN. El proceso de transposición puede controlarse fácilmente separando la transposasa del resto de secuencia de ADN que compone el transposón, convirtiéndolo en un elemento móvil no autónomo. En este sistema el elemento sólo podrá movilizarse si se le suplementa con la transposasa.
 

Estado actual
La animación describe de forma automática el mecanismo de acción de las trasposasas de clase II

Transposones como herramientas para vehicular ADN

Los transposones se habían usado en invertebrados (C. elegans y Drosophila) para generar transgénicos y generar mutantes por inserción, pero hasta la reactivación del Sleeping Beauty no se disponía de un transposón lo suficientemente activo como para utilizarlo para estas funciones. Más tarde aparecieron otros elementos que catalizaban eficientemente la transposición en vertebrados. Los criterios básicos para su elección son:
 

  • Suficiente actividad transposicional
  • Que no existan copias en el genoma diana
  • Capacidad de carga de ADN
  • Que tenga sitios preferentes de integración



Capacidad de carga de ADN

La tolerancia para incluir distintos tamaños de ADN varía de unos transposones a otros. Miembros de la familia Tc1/mariner no toleran tamaños grandes. En este caso una opción es construir un transposón de tipo “sándwich” que incluye el ADN a transponer situado entre 2 transposones completos, uno a cada lado. Esto permite la transposición de transgenes de gran tamaño.

Los transposones de tipo piggyBac11, Tol1 y Tol2 toleran mejor transgenes complejos de gran tamaño, proporcionando una transposición eficiente también en esos casos.

Preferencia por sitios de integración específicos

Los sitios preferentes de integración determinan muchas veces la utilidad de los transposones para diferentes aplicaciones. Para establecer protocolos de terapia génica humana al menos sería exigible que los transposones que se usaran como vector mostraran preferencia por los genes diana, especialmente por razones de seguridad. En cambio, para seleccionar mutantes que cubran el mayor número de genes de un organismo es preferible que, en general, tiendan a insertarse dentro de genes, sin preferencia por unos genes concretos. El patrón de inserción de la mayoría de los transposones no es de inserción al azar sino que suele presentar muchos “hotspots” y “cold regions” si se analizan las inserciones a escala de genoma. Por eso si se quieren generar mutantes que cubran todo el genoma es preferible contar con varios transposones que tengan distintas preferencias de inserción.

Transposones como vectores para transgénesis estable de genes a células madre y generación de células madre pluripotentes inducidas

Tecnologías basadas en transposones pueden ser eficaces para transferir genes a cultivos celulares. Por ejemplo se pueden introducir horquillas (hairpins) cortas en cromosomas para obtener un sistema de bloqueo mediante interferencia por ARN. Los transposones son vectores prometedores para terapia génica y celular. La eficiencia en la transferencia estable de genes por el sistema SB es similar a la obtenida con vectores virales.

El reciente descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs: induced Pluripotent Stem Cells) abre un futuro prometedor para la medicina regenerativa. Con sólo inducir la expresión de los genes que codifican las proteínas Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc se consigue transformar células somáticas en células pluripotentes con capacidades similares a las células madre embrionarias. Inicialmente esto solo podía conseguirse mediante retro o lenti-viral transducción, limitando su aplicación clínica por motivos de seguridad. La variante hiperactiva SB y los transposones piggyBac muestran una eficiencia comparable a la de los vectores virales en la transgénesis. Además el mecanismo “cortar y pegar“ muchas veces no se completa y en los casos en los que se corta sin pegarse el transposón desaparece. Esto permite la eliminación del transgen una vez completada la reprogramación. Ya se ha conseguido generar iPSCs mediante el sistema de trasposición piggyBac y la eliminación del transgen que contenía los factores responsables de la reprogramación celular. Es cierto que aún falta cerrar del todo la posibilidad de que el transposón salte a una nueva localización durante su proceso de eliminación del genoma, pero la reprogramación celular usando transposones como vector augura un futuro brillante a la medicina regenerativa.

Transgénesis en oocitos y embriones

En vertebrados, los métodos clásicos para expresar genes no presentes en el genoma se basan en la micro-inyección de construcciones de genes en oocitos o en huevos fertilizados. Esto tiene varios problemas como:
 

  • Baja tasa de integración
  • Integración de varias copias repetidas seguidas, lo que muchas veces causa el silenciamiento de su expresión
  • La integración se produce tarde en el desarrollo lo que causa mosaicismo con respecto al transgen.



Todos estos problemas se pueden solucionar usando transposones. En este sentido se ha desarrollado ya un sistema basado en la transposasa hiperactiva SB100X que permite una transgénesis del 45% en embriones de ratón.

Mutagénesis a escala genómica

La mutagénesis de genes específicos permite diseccionar su función pero en la mayoría de los casos la función de un gen no puede analizarse aisladamente. Es necesario estudiar cada gen dentro de las rutas biológicas en las que participa. La mutagénesis insercional a escala de genoma realizada con transposones permite este tipo de estudios globales y es una de la las tecnologías más productiva y versátil de las existentes para bloquear y manipular genes a escala de genoma.

La mutagénesis insercional en células somáticas plantea el reto de trabajar con genomas diploides. La inactivación de las 2 copias de un gen suele ser siempre necesaria para detectar cambios fenotípicos, pero la probabilidad de generar mutaciones bialélicas de un mismo locus es extremadamente baja. Las células embrionarias deficientes en Blm tienen una elevada tasa de recombinación homóloga con lo que tienden a perder la heterocigosidad y en muchos casos pueden convertir una mutación simple en una bi-alélica. El sistema Blm se usa para realizar mutagénesis insercional a escala genómica en células somáticas. Se ha usado el transposón piggyBac en células madre embrionarias de ratón Blm-deficientes, para buscar componentes involucrados en la reparación de ADN. Este sistema fue capaz de detectar 4 genes involucrados en reparación de ADN mientras que previos estudios que usaban como vector retrovirus sólo fueron capaces de detectar 2 genes.

En el sistema experimental de 2 componentes la transposición está controlada por la trans-suplementación de la transposasa. En este sistema se acopla por un lado la transposasa, y por otro un sistema de captura de genes (gene-trapping) que se encarga de la mutagénesis y de proporcionar una señal detectable para poder seleccionar los mutantes. Las construcciones para captura de genes llevan en 3’ un sitio para splicing alternativo, un gen que codifica una proteína “reporter” que sea fácilmente detectable directa o indirectamente (fluorescencia, color) y en 5’ una secuencia poli-A que determina la terminación de la transcripción. El sistema de 2 componentes al insertarse en un intrón bloquea la expresión del gen en el que se inserta, pero permite la transcripción del gen reportero que sirve para seleccionar los mutantes. Se han usado sistemas de transposición de 2 componentes basados en el uso los transposones SB, Minos, PiggyBac y Tol2.

Mutagénesis con LINE-1

El uso del retrotransposon LINE-1 para mutagénesis tiene varias ventajas:
 

  • Como su mecanismo de transposición es de tipo “copiar y pegar” el donante se mantiene estable.
  • Se pueden diseñar de forma que la transposición se produzca una sola vez
  • La retro-transposición puede controlarse usando sistemas como Cre-loxP



Un problema del uso de LINE-1 es que un 90% de las transposiciones se asocian con reordenamientos y esto puede dificultar la determinación de los nuevos sitios de inserción.

Transposones en sistemas experimentales de cáncer

SB ha sido usado en ratón para sobre-expresar genes y generar modelos animales de cáncer experimental. El sistema es similar al basado en retrovirus pero permite establecer tumores en regiones como hígado y cerebro en las que antes no era posible. El sistema que asocia SB a un sistema de captura de oncogenes permite tanto bloquear la expresión de oncogenes como sobreexpresarlos.
 

Conclusiones
En la tabla se recoge una lista de los transposones activos en vertebrados

Una aplicación obvia es la transgénesis de animales de laboratorio. Las nuevas tecnologías basadas en transposones son aplicables también a especies de gran tamaño como vaca, oveja y cerdo. El reciente desarrollo del transposón hiperactivo SB100X permite transferir genes a tipos celulares primarios, incluyendo células madre, con una eficiencia y estabilidad sin precedentes lo que va a facilitar la implementación clínica de terapias génicas tanto ex vivo como in vivo.

Las nuevas tecnologías basadas en transposones aportan la posibilidad de generar librerías de knockouts de genes específicos en modelos experimentales de enfermedades humanas en especies para las que no existe otro sistema de generación de knockouts. Esto permitirá estudiar mejor nuevas terapias en las especies cuyo modelo de enfermedad se acerca más a la enfermedad humana

Los recientes avances en la reprogramación hacia iPSCs podrían facilitar la identificación de los determinantes genéticos involucrados en rutas fisiológicas o patológicas en células derivadas de pacientes con enfermedades genéticas específicas.

Las tecnologías basadas en transposones tienen un enorme potencial en el desarrollo de herramientas genómicas que posibiliten la conexión de la fisiología y la genética a nivel práctico.
 

Bibliografía