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Fibao Una perspectiva molecular en medicina
TECNICAS
Sistema de dos híbridos
Etiopatogenia
Diagnóstico
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Fecha de Publicación: 2-9-2008 Última actualización : 2-9-2008
Resumen
La técnica denominada sistema de dos híbridos o sistema del doble híbrido o Y2H (Yeast two hybrid) se utiliza para detectar interacciones entre proteínas y ha sido especialmente útil para estudios a gran escala ya que permite analizar grandes conjuntos de proteínas en un único experimento global.
Concepto
Se parte de un factor de transcripción con 2 dominios separables e imprescindibles ambos para que se produzca la expresión de un gen. El dominio indicado en la figura como dominio A suele ser el dominio sensor que se activa cuando interactúa con una sustancia como por ejemplo galactosa. El dominio B es el dominio que reconoce la diana de unión en el ADN. Se consigue que ambos dominios se expresen separadamente y se genera una genoteca para cada uno de los dominios. Así contamos con un conjunto A en el que los genes a investigar están unidos al dominio A y otro conjunto B en el que están unidos al dominio B. Si se produce la interacción entre proteínas de fusión correspondientes a conjuntos distintos se activará la expresión del gen reportero que será detectada.
Muchos factores de transcripción constan de 2 dominios, ambos imprescindibles para que se produzca la expresión del gen que regulan. La técnica Y2H se basa en esta característica de algunos factores de transcripción. Un conjunto de proteínas se fusiona a uno de los dominios (dominio A) del factor de transcripción y el otro conjunto al otro dominio (dominio B). Esto se consigue utilizando técnicas de ingeniería genética con las que se generan 2 genotecas, una con genes fusionados al dominio A (conjunto A) y la otra con genes fusionados al dominio B (conjunto B). Los plásmidos con los genes fusionados se integran en levaduras y sólo cuando interactúan proteínas de ambos conjuntos los dos dominios del factor de transcripción se unen y son capaces de inducir la expresión del gen regulado por ese factor de transcripción. Este gen es un gen llamado “reportero” que permite detectar su expresión porque suele ser el gen de una enzima cuya expresión produce la síntesis de un producto fácilmente detectable. Muchas veces se ha utilizado como gen reportero el gen lacZ que codifica la enzima beta-galactosidasa que metaboliza la galactosa y en el ensayo habitual produce un color azul en las colonias positivas en las que se ha producido una interacción entre una proteína del conjunto A y otra del conjunto B.

Durante los últimos años este tipo de ensayo ha sido muy útil para detectar a gran escala interacciones entre proteínas. Así por ejemplo se han analizado proteomas completos detectando nuevas interacciones entre proteínas y colaborando de forma significativa a aumentar el conocimiento de las complejas redes de interacción entre proteínas de un organismo completo.

La debilidad de esta técnica es que puede dar muchos falsos positivos sobre todo en los ensayos a gran escala ya que se expresan juntas y a la vez proteínas que en condiciones fiosiologicas no tienen por qué coincidir nunca en el espacio (pueden expresarse en compartimentos o tipos celulares distintos) ni en el tiempo (su regulación puede hacer que nunca se expresen a la vez). Las distintas modificaciones postraduccionales (fosforilación, glicosilación …) son otra de las causas de algunos falsos positivos ya que este tipo de modificaciones puede impedir que ocurran en estado fisiológico interacciones detectadas por el sistema Y2H. Aún así es un filtro de selección realmente útil que ha permitido descubrir importantes interacciones que han podido ser confirmadas posteriormente por técnicas más específicas como la coinmunoprecipitación.