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Pirosecuenciación
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Fecha de Publicación: 2-3-2009 Última actualización : 3-3-2009
Resumen
La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN basado en la monitorización a tiempo real de la síntesis de ADN. Esta técnica se conoce desde hace algunos años, pero gracias al impulso dado al desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación más eficientes y baratas se han conseguido una serie de mejoras que han hecho posible la aplicación de esta técnica para la secuenciación a una escala genómica y con bajo coste. Existen varias tecnologías basadas en los principios de la pirosecuenciación, uno de ellas es el sistema GS FLX de Roche que a continuación describimos como ejemplo.
Concepto
Los avances en tecnologías de secuenciacdión permiten incrementar el rendimiento y bajar los tiempos y costes de obtención de datos.
Un aspecto importante de esta técnica es que todos los pasos se realizan “in vitro”, a diferencia de la tecnología Sanger. Esta técnica comienza con el procesado y adaptación del ADN para obtener una librería de pequeños fragmentos monocatenarios. Lo primero es fragmentar el ADN a secuenciar mediante un proceso físico conocido como “nebulización” donde el ADN se rompe en fragmentos de 200 a 800 pares de bases aproximadamente.

Posteriormente, mediante protocolos estandarizados de biología molecular, se añaden dos pequeñas secuencias adaptadoras a cada fragmento de ADN obtenido en la nebulización. El adaptador A y el B. Las secuencias adaptadores están diseñadas para cumplir funciones en los pasos de selección, amplificación y secuenciación.

El siguiente paso es seleccionar los fragmentos de ADN a los que se han unido correctamente los adaptadores. Para esto, los fragmentos de ADN se unen a unas esferas especiales por la parte 3´ del adaptador B. Esta unión no es por complementariedad de bases. Los fragmentos que solo contengan adaptador A no se unirán a las esferas y son eliminados y los que contengan dos adaptadores B se unirán por dos puntos. Los fragmentos de doble cadena unidos a estas esferas son sometidos a alta concentración de NaOH que provoca la separación de las cadenas simples. Si el fragmento tiene dos adaptadores B se separarán las cadenas pero ambas permanecerán unidas a las esferas. Como resultado de este sencillo proceso se liberan de las esferas los fragmentos de cadena simple que tienen un adaptador de cada clase con el B situado en el extremo 5´ del fragmento, ya que los fragmentos complementarios a estos permanecerán unidos por el extremo 3´ del adaptador B.

Para el proceso de amplificación, los fragmentos libres de cadena simple se unen a otras esferas que tienen un gran número de secuencias complementarias del adaptador A. Esta unión está optimizada para que solo se una un fragmento a una esfera. Una vez unidos los fragmentos a las esferas se introducen en una emulsión de agua y aceite de forma que cada esfera quede dentro de una gota con todos los reactivos y encimas necesarios para la PCR. Tras una serie de termociclos de PCR se habrán generado en cada esfera un gran número de secuencias de doble cadena idénticas y unidas por el adaptador A. De nuevo, las esferas son sometidas a alta concentración de NaOH para separar las cadenas complementarias. El resultado es que cada esfera tiene adherido a su superficie un gran número de cadenas simples idénticas unidas por el extremo 3´.

Antes de empezar la secuenciación en sí misma se añaden cebadores complementarios al adaptador B en posición 5´, ADN polimerasas y los cofactores necesarios para la síntesis de la cadena complementaria a los fragmentos unidos a las esferas.

El siguiente paso es cargar las esferas en un dispositivo conocido como “PicoTiterPlate” que es el que se introduce en el secuenciador. Este dispositivo consta de más de un millón de pocillos de 44 micras de diámetro de forma que solo quepa una esfera con fragmentos de ADN por pocillo. Además de las esferas con ADN, se introducen otro tipo de esferas que contienen las enzimas necesarias para detectar la incorporación de nucleótidos durante la síntesis de la cadena complementaria.

Estas enzimas son la sulfurilasa y la luciferasa. La sulfurilasa genera ATP a partir de pirofosfato y la luciferasa se transforma en oxiluciferina en presencia de ATP con emisión de luz. De esta forma se construye una cascada enzimática que empieza cuando la ADN polimerasa incorpora un nucleótido a la cadena creciente complementaria del ADN a secuenciar liberando un pirofosfato y termina cuando la luciferasa emite luz.

Una vez cargadas las esferas con ADN y las esferas con enzimas, el “PicoTiterPlate” se introduce en el secuenciador. El secuenciador automatiza el proceso de secuenciación, la captura de imágenes y su interpretación. El secuenciador vierte automáticamente sobre los pocillos los reactivos necesarios y un tipo de nucleótido cada vez. Así de forma cíclica se irán vertiendo As, Cs, Gs y Ts. En cada pocillo, la ADN polimerasa añadirá uno o más nucleótidos dependiendo de la secuencia que actúa como molde y se emitirá luz con una intensidad proporcional al númerro de nucleótidos incorporados a la nueva cadena que se va sintetizando durante el proceso de secuenciación. El secuenciador consta de un sistema óptico especial que recoge el patrón de destellos luminosos que se emiten en el “PicoTiterPlate”. Mediante programas informáticos se interpretan estos patrones de luz y se generan unas gráficas que indican si ha habido incorporación o no de nucleótidos y su número.

Después de esto se lava el exceso de nucleótidos y reactivos y se repite el proceso con otro tipo de nucleótido de forma cíclica hasta que finalice la síntesis de una cadena complementaria a la cadena que actúa como molde. El resultado es la secuenciación de los fragmentos que hay en cada pocillo.

En los adaptadores hay unas secuencias conocidas que sirven para calibrar los aparatos de recepción e interpretación de imágenes. Uno de los defectos de este sistema es la pérdida de precisión en las regiones homopoliméricas.

La posibilidad de automatizar y de paralelizar el proceso de secuenciación que ofrece esta técnica es una de las principales ventajas frente a otros métodos de secuenciación. La pirosecuenciación permite la secuenciación de grandes cantidades de ADN en menos tiempo que otras técnicas y con un coste menor.
Vínculos externos de interés
Bibliografía