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Fibao Una perspectiva molecular en medicina
TECNICAS
Sensores nanomecánicos para detectar priones
Tratamiento
Etiopatogenia
Diagnóstico
Pronóstico
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Fecha de Publicación: 24-3-2009 Última actualización : 24-3-2009
Resumen
Desde hace un tiempo los sistemas micro y nanoelectromecánicos (MEMS y NEMS) están siendo desarrollados como sensores químicos y biológicos capaces de detectar pequeñas cantidades de sustancias. En este caso en particular, se ha desarrollado un protocolo para detectar proteínas priónicas (PrP) con una concentración de 2 nanogramos/ml gracias a un doble marcaje de masa.
Concepto
Nanosensor diseñado para detectar leves variaciones de masa
La nanofabricación usa tecnologías y metodologías específicamente diseñadas para crear objetos a escala nanométrica. Los sistemas micro o nanomecánicos están diseñados para transducir señales de distinta naturaleza (química, térmica o magnética, entre otras) a movimiento mecánico. La parte móvil del sistema se conoce como resonador y su movimiento responde a un movimiento armónico con una frecuencia proporcional a varios factores, entre ellos la masa del resonador y la viscosidad del medio.

Para tener una imagen mental de la estructura de un resonador podemos imaginar el trampolín de una piscina. Este “nanotrampolín” es tan sensible que puede medir diferencias de temperatura de 10 (exp -5) K, de forma que la mayor dilatación de uno de los lados iniciará el movimiento armónico. El resonador puede medir diferentes señales dependiendo de cómo esté diseñado. Así, si añadimos elementos metálicos podremos medir campos magnéticos. En este caso queremos detectar la masa de las proteínas priónicas. Para esto lo ideal es que las proteínas se depositen en el extremo del resonador aumentando la sensibilidad (los saltadores se colocan en el extremo del trampolín para conseguir un mayor desplazamiento).

El MEMS usado en este caso se construyó de la siguiente forma. Mediante una técnica conocida como deposición química de vapor, se consiguió depositar una capa de 200 nm de grosor de Nitruro de Silicio (Si3N4) sobre una capa de silicio oxidado térmicamente. Posteriormente se modeló uno de los bordes para recortar los resonadores de nitruro de silicio y que tuvieran libre movimiento sin un soporte inferior de silicona oxidada. Cada MEMS consistía en un bloque con aproximadamente 1000 resonadores cada uno, constituyendo un chip. Cada resonador tenía forma de T, maximizando la superficie del extremo libre con unas dimensiones de 3 x 10 micrómetros.

Sin un marcaje de masa adicional, las proteínas priónicas (PrP) no pueden medirse a concentraciones inferiores a 20 microgramos/ml. Si las inmovilizamos entre dos capas de anticuerpos, a modo de bocadillo, sobre la superficie del resonador, la sensibilidad analítica mejora hasta los 2 microgramos/ml. Al usar además nanopartículas que se unan al segundo anticuerpo se puede llegar a una sensibilidad de 2 nanogramos/ml.

Para combinar este doble marcaje de masa con los resonadores, después de construir los dispositivos, los resonadores se preparan para detectar moléculas orgánicas. En este caso se añadió a la superficie de los resonadores APTES (Aminopropiltrietoxisilano) y glutaraldehído (GA) que actuará de puente entre los grupos de aminas libres de silano y de los anticuerpos primarios.

Después de esta preparación se suceden una serie de pasos secuenciales de incubación, lavados y bloqueo de grupos reactivos de forma que primero depositamos una capa de anticuerpos primarios en la superficie del resonador, después se depositan las proteínas priónicas y luego otra capa de anticuerpos secundarios. Esta segunda capa de anticuerpos es el primer marcaje de masa, ya que solo se unen a las PrP. Los anticuerpos secundarios son biotilinados después de su unión y son capaces de unir estreptavidina que ha sido previamente conjugada con nanopartículas, lo que constituye el segundo marcaje de masa.

Una vez preparado el chip con los marcajes de masas se procede a la medición de las frecuencias de los resonadores. La frecuencia de resonancia es una función que no sólo depende de la masa y que tiene diferentes parámetros que pueden ser usados potencialmente en aplicaciones de sensor, pero en el caso de la masa su sensibilidad analítica es del orden de femtogramos o menos.

Los resonadores son excitados en vacío usando técnicas ópticas. Un láser a 405 nm incide cerca del extremo no libre de los resonadores. Debido a la alta conductividad térmica del nitruro de silicio en comparación con la capa inferior de dióxido de silicio se genera un gradiente de temperatura que es responsable de una expansión térmica no homogénea de las dos capas. Esto causa un desemparejamiento de las capas y activa la vibración de los resonadores. Un segundo láser incidente en el extremo libre de los resonadores mide esta vibración. La capa dinámica cambia el grado de interferencia óptica del láser incidente, modulando la intensidad reflejada según la frecuencia de resonancia del dispositivo. La frecuencia dependerá de la masa y ésta a su vez de las PrP que se hayan unido. Cuanto mayor masa se encuentre en el resonador, menor será la frecuencia de resonancia. La luz reflejada se recoge por un fotodetector y mediante un analizador espectral se deducen las frecuencias de los resonadores.

Estos nanosensores son de interés diagnóstico ya que su pequeño tamaño y alta sensibilidad, los hacen idóneos para su integración en sistemas analíticos miniaturizados. Además, los métodos de fabricación permiten la creación de varios aparatos que pueden ser diseñados y optimizados según los requerimientos de la sustancia a detectar. En este caso debido a la alta sensibilidad del sistema de detección basado en resonadores, podrían ser dispositivos adecuados para aplicar un test antemortem que detecte directamente los PrP en los fluidos corporales.

Bibliografía