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TECNICAS
Método híbrido de selección de secuencias diana para secuenciación masivamente paralela
Etiopatogenia
Diagnóstico
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Fecha de Publicación: 24-8-2009 Última actualización : 24-8-2009
Resumen
Los nuevos métodos de secuenciación masivamente paralela necesitan de nuevos métodos de selección de las secuencias diana a secuenciar. Esta técnica es un nuevo método de captura de secuencias que usa secuencias de ARN biotinilado como señuelo (bait) para pescar las secuencias diana en el conjunto global de fragmentos de ADN.
Concepto
La animación describe una nueva técnica para obtener muestras enriquecidas en secuencias diana para su secuenciación con técnicas de secuenciación masiva paralela
Las nuevas tecnologías de secuenciación masivamente paralela permiten secuenciar con un costo mucho menor.

Secuenciar genomas humanos completos será una aplicación importante de los nuevos sistemas de secuenciación pero en muchos casos se necesitará secuenciar conjuntos específicos de secuencias, no el genoma completo. Así, por ejemplo, en muchos casos interesará secuenciar sólo el exoma (fracción codificante del genoma correspondiente a exones) que supone sobre el 1% del genoma humano. Y en muchos otros sólo interesará secuenciar regiones codificantes correspondientes por ejemplo al conjunto de genes relacionados con una enfermedad concreta. Poder seleccionar de forma específica lo que interesa secuenciar es muchas veces determinante para hacer posible un proyecto de secuenciación.

Hasta ahora se han utilizado 2 métodos de selección de secuencias diana adaptados a las nuevas tecnologías de secuenciación masiva:

  • Captura con microarrays basada en hibridación a oligonucleótidos sintéticos complementarios a las secuencias diana a seleccionar. Este sistema captura mejor fragmentos de unas 500 bases.
  • Amplificación “multiplex” que utiliza un complejo proceso en el que intervienen: síntesis de oligonucleótidos sobre un array, enzimas de restricción, hibridación, circularización y complejos procesos de amplificación. Con este método no se consiguen ni la uniformidad ni la eficiencia deseadas en la obtención de las secuencias diana.
En este trabajo se describe un método híbrido que combina la flexibilidad y economía de la síntesis de oligonucleótidos en un array con la cinética de la hibridación en solución.

Se sintetiza en paralelo un pool de oligonucleótidos sobre un microarray. Cada oligonucleótido consiste de una secuencia diana de 170 bases flanqueada por 15 bases correspondientes a un primer universal que permite su amplificación por PCR. Tras esta primera amplificación se le añade mediante PCR el promotor T7. La transcripción in vitro en presencia de UTPs biotinilados genera ARNs marcados que sirven como “señuelo” (bait) para “pescar” las secuencias diana de interés en el conjunto de fragmentos de ADN total. El proceso de hibridación lo conducen los ARNs que se encuentran en exceso con respecto a los fragmentos de ADN amplificados del ADN total. Los ADNs capturados se extraen con bolitas magnéticas cubiertas con estreptavidina, se amplifican por PCR y se secuencian con métodos NGS (Next Generation Sequencing).

Este método híbrido permite preparar grandes cantidades de secuencias “bait” con un mismo array de oligonucleótidos que puede ser testado en cuanto a calidad y usado muchas veces dentro de un proyecto de secuenciación a gran escala.
Vínculos externos de interés
Bibliografía