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TEMAS
smallRNAs
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Fecha de Publicación: 24-3-2009 Última actualización : 24-3-2009
Resumen
smallRNAs (pequeños ARNs) tienen como diana tanto la cromatina como los transcritos con lo que ejercen un amplio control tanto sobre el genoma como sobre el transcriptoma. Gracias a los recientes progresos en la secuenciación a gran escala se ha descubierto un sorprendente y complejo panorama de pequeñas moléculas de ARN en las células eucariotas. El término “small RNA” no debe confundirse con otros términos parecidos dentro de la gran variedad de tipos de ARNs que se han encontrado en el interior de las células. Lo que distingue a los small RNAs y es la base de su clasificación es su mecanismo biogenético, su pequeño tamaño (de 20 a 30 nucleótidos) y el tipo de proteína Argonauta al que están asociados (Ago o Piwi). Se clasifican en tres grupos: MicroRNAs (miRNAs), pequeños RNAs endógenos de interferencia (endo-siRNAs o esiRNAs) y RNAs de interacción con Piwi (piRNA).

Los small RNAs están implicados en casi todos los procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación y proliferación celular, la muerte celular, el control metabólico, el silenciamiento transposónico y la defensa antiviral.
Concepto
Esquema de la biosíntesis de miRNAs.
El más estudiado de los tres grupos es el de los miRNA. Se generan a partir de unas estructuras en horquilla por la acción de dos proteínas RNasa tipo III: Drosha y Dicer. Los miRNA maduros tienen una longitud de 22 nucleótidos y se unen a la subfamilia Ago de proteínas. Se unen a mRNAs y actúan como reguladores post-transcripcionales.

Los piRNAs son los más grandes, de 24 a 31 nucleótidos, y se asocian con la subfamilia Piwi de proteínas. Su biogénesis no depende de Dicer y son moléculas altamente abundantes en células germinales. Al menos algunas de ellas están involucradas en el silenciamiento transposónico a través de la formación de heterocromatina o la desestabilización del ARN.

El grupo de endo-siRNA se ha estudiado fundamentalmente en Drosophila. A pesar de su similaridad con miRNAs por su asociación con las proteínas de la familia Ago, difieren de estas en que derivan de una larga molécula de ARN bicatenario (dsRNAs) y dependen de Dicer pero no de Drosha.

miRNAs:

Funcionan como moléculas guía en la regulación post-transcripcional de genes al emparejarse con las bases de ARNm. Este reconocimiento se realiza normalmente en la región 3´ no traducible (UTR: UnTranslated Region) del mensajero y lleva a una represión traduccional y a una degradación exonucleolítica del mensajero. Aunque también se han descrito otros mecanismos de regulación como activación traduccional y formación de heterocromatina. Se predice que un tercio de los genes humanos son dianas para miRNAs, por lo que la combinación única de miRNAs en un tipo celular influirá en el paso a proteína de miles de mensajeros.

Los genes para miRNA están muy conservados filogenéticamente. El 55% en C.elegans tiene homólogos en humanos, donde se han descrito 695 genes, lo que indica un papel significativo en la evolución de animales. En la mayoría de los mamíferos los genes de los miRNAs tienen multitud de parálogos, probablemente originados por duplicación génica y es posible que con distintos papeles in vivo. El 50% de los loci que codifican miRNAs se encuentran cerca de otros, lo que origina que se transcriban en grupos conocidos como unidades de transcripción policistrónica (TU: Transcription Units).

Los loci de los miRNA pueden estar en regiones intrónicas o exónicas de TUs. Su transcripción esta mediada por RNA polimerasa II (Pol II), aunque hay un grupo minoritario asociado a repeticiones Alu que son transcritos por la polimerasa Pol III. De esta forma, los factores de transcripción que regulan Pol II controlarán también la expresión de miRNAs. En consecuencia, los miRNAs están regulados por el tipo celular y condiciones específicas.

Vamos a describir la principal vía biogénica de miRNAs: Poll II genera un transcrito primario (pri-miRNAs) de varias kilobases de longitud. En este transcrito monocatenario se producen unas estructuras de plegamiento secundario, donde un pequeño segmento palindrómico se autoaparea por complementariedad de bases formando un “stem-loop” u horquilla compuesta por un fragmento apareado y un pequeño bucle en el extremo. En el núcleo de las células, la proteína Drosha reconoce a esta estructura y la corta por la zona de doble hebra, para lo que necesita a la proteína DGCR8. Este corte libera al pre-miRNA, que consta de un segmento de doble cadena de 33 nucleótidos con un extremo libre y en el otro un bucle de cadena simple. Según estudios recientes la liberación de pre-miRNA se produce simultáneamente a la transcripción del pri-miRNA y antes de que se inicie el proceso de splicing.

El pre-miRNA pasa al citoplasma en un proceso mediado por la proteína exportina 5. Una vez en el citoplasma la proteína Dicer reconoce al pre-miRNA y corta el bucle del extremo liberando un fragmento de doble cadena de 22 nucleótidos. Una de las dos hebras de este ARN duplex se carga en una proteína de la subfamilia Ago para generar el complejo efector RISC, mientras que la otra cadena es degradada. La elección de la cadena puede deberse a factores termodinámicos. La cadena con una relativa inestabilidad de bases en el extremo 5´es la que se carga en la proteína Ago.

El control de la síntesis de miRNA es fundamental. Es necesario un control muy fino de los miRNA para mantener las funciones celulares. La disregulación de este control está asociada a enfermedades como el cáncer. El control de la transcripción es el principal mecanismo que regula la producción de miRNAs. Los factores de transcripción asociados a Poll II están implicados en la regulación de los niveles de miRNA. Algunos miRNAs están bajo el control de factores de transcripción oncogénicos como MYC, que alteran la expresión de cierto número de miRNAs implicados en el ciclo celular y la apoptosis. También intervienen en la regulación de los miRNAs proteínas supresoras de tumores como p53 que activa a la familia de miRNA miR-34. Las modificaciones epigenéticas también influyen en el patrón de expresión de miRNA. Así, por ejemplo, el locus de miR-203 sufre frecuentemente metilación en el ADN en el linfoma de células T pero no en linfocitos normales. Los miRNAs también sufren control post-transcripcional fundamentalmente relacionado con el procesamiento realizado por la proteína Drosha.

Se han observado circuitos de retroalimentación en las redes de biogénesis de miRNAs que incluyen a factores de transcripción, a los propios miRNA y a sus dianas. Las proteínas Drosha y Dicer son controladas por bucles de retroalimentación negativos para mantener la homeostasis en la producción de miRNA.

piRNAs:

Estas moléculas fueron descubiertas analizando perfiles de expresión de smallRNAs estudiando el desarrollo de Drosophila melanogaster. Son un subconjunto de smallRNAs específicos de células germinales. La mayoría derivan de elementos intergénicos repetitivos que suelen estar agrupados, incluyendo retrotransposones. Los piRNAs son de mayor tamaño que los miRNA, oscilando entre 24 y 29 nucleótidos, y se asocian a la subfamilia PIWI de proteínas. Estas proteínas son esenciales para la autoregeneración de células madre germinales y el control de la movilidad de transposones.

En mamíferos, ratones concretamente, se han identificado dos tipos de piRNA:
  • Un tipo denominado pre-paquitene, que se expresa antes de esta fase mitótica y deriva de regiones ricas en grupos de transposones. Este tipo se asocia a las proteínas MIWI2 y MILI.
  • El otro tipo se llama paquitene y empieza a ser abundante en esta fase, donde se han detectado más de 80000 especies distintas derivadas de clusters genómicos de más de 200 kilobases. Se asocian con las proteínas MIWI y MILI.
Los piRNA pre-paquitene se parecen a los encontrados en D. melanogaster en cuanto a su mecanismo de formación por un ciclo ping-pong. En este ciclo los piRNA con proteínas MIWI2 generan el piRNA que contiene MILI y viceversa. Estos piRNA tienen un papel en la estabilización de la metilación de novo de transposones ADN en células germinales en fetos femeninos, sugiriendo un papel en el silenciamiento transcripcional de genes a través de la metilación. Otros experimentos, con mutantes de Mili y Miwi2, mostraron la eliminación de la metilación del ADN en las regiones promotoras de LINE1 (Long Interspersed Nuclear Element 1), originando la infertilidad de los machos.

Endo-siRNAs:

Gracias a la secuenciación se logró identificar esta clase de small RNAs en células de moscas. Tienen una longitud de 21 nucleótidos y pueden derivar de transpososnes, de parejas de transcritos sentido-antisentido y de grandes estructuras de tipo “stem-loop”. Se asocian a la proteína AGO2. Su biogénesis depende de Dicer y de otras proteínas con actividad nucleolítica como R2D2 y LOQS.

Es necesario precisar que existen siRNA exógenos (exo-siRNA), parecidos a los endógenos, que surgen de ARN ectópico de cadena doble (dsRNA o siRNA) y también se asocian con AGO2 en el citoplasma.

Hay varios tipos de precursores para endo-siRNAs:
  • Pares de ARN sentido-antisentido que si provienen del mismo loci se llaman precursores cis-endo-siRNA y si provienen de loci diferentes, aunque parecidos, se llaman trans-endo-siRNA. Es usual encontrar desemparejamientos de bases y pequeños abultamientos en la doble cadena. Existen evidencias que estos bucles pueden ser generados por un proceso de edición de ARN mediado por la proteína ADAR, cuya actividad está restringida al núcleo. Se ha visto que los transcritos de pseudogenes pueden originar siRNAs al emparejarse con los transcritos de su homólogo funcional, lo que originaria el silenciamiento de este último.
  • Un segundo tipo de precursor endo-siRNA es un transcrito de cadena simple, auto-hibridable, que forma una estructura de de tipo stem-loop. Se distinguen de los precursores de miRNA por la gran longitud del stem-loop.
El transporte hacia el citoplasma de los ARNs precursores de cadena doble y monocatenarios se realiza por mecanismos aún desconocidos. Pero una vez en el citoplasma sirven de sustrato a Dicer 2 para generar los endo-siRNA.

En los oocitos de ratón se expresan piRNAs y endo-siRNAs. De esta forma en ovarios, el silenciamiento trasposónico se produce por dos vías. A lo largo de la evolución los transposones han sido regulados de forma diferente en machos y hembras. SmallRNAs componen inmensamente complejos networks. Aunque cada miRNA suprime su diana de forma moderada, los miRNAs en conjunto pueden ejercer efectos importantes y amplios ya que ejercen su efecto sobre grandes conjuntos de genes y además están involucrados en importantes mecanismos de retroalimentación con otros factores reguladores. Así los miRNAs son como puntos centrales de tipo “hub” dentro de los networks de regulación génica y tienen un gran flujo de información. Es necesario profundizar en el conocimiento de los smallRNAs para de verdad entender la regulación génica poder diseñar mecanismos de intervención orientados a corregir sus disfunciones.
Bibliografía